二代测序的基础
2024.09.10
新一代测序
过去十来年，二代测序（NGS）技术大力促进了生物学和医学各领域的发展，包括基因组学、个性化医学和进化生物学。NGS 可以对整个基因组（DNA）或转录组（RNA）进行全面研究，高通量鉴定序列变异，并进行单细胞分析，为基因组结构、功能和变异性提供新的见解。
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测序文库的制备是 NGS 成功应用的基础，涉及从 DNA 或 RNA 样品中生成适合测序格式的修饰核苷酸片段。整个测序过程和随后的生物信息分析都受到文库制备质量的影响。通过精心的文库制备，可以优化测序结果，最大限度地减少测序过程中固有的技术偏差或人工痕迹，提高测序覆盖度，这对于珍贵的样本材料尤为重要。
制备 NGS 测序文库 - 分步进行
- 片段化：除了超声或声波剪切外，还有更为特异和温和的样本处理方法，如酶解片段化。
- 反转录：反转录是在基因扩增仪中进行的一个酶法反应，这一过程将RNA转化为互补DNA（cDNA），进而进行下游测序。无论使用哪种测序技术，文库制备通常都会涉及多个步骤。
- 末端修饰：补平DNA片段的末端，使其可与测序接头连接。
- 连接接头：将测序接头连接到DNA片段末端，以便与测序平台的流动池互补结合。
- 标签/条形码：每个文库中都添加了独特的短序列标签，以便在测序后区分所有样本并进行生物信息学分析。这些标签也可用于多重测序，通过不同标签序列的多种组合，在一次测序中检测更多样本。
- PCR 扩增：通过 PCR 扩增文库，将测序文库扩增到适合测序的水平。
- 片段大小选择/纯化：选择并纯化大小合适的DNA片段，确保制备高质量的文库。
- 质量控制：对制备的文库进行浓度和大小分布评估。
- 归一化和文库合并：对文库浓度进行归一化和混样合并，以便同时对多个样本进行测序。
信息图表
第一步：提取核酸
核酸提取是将 DNA 或 RNA从生物基质中分离出来的第一步，有助于后续的处理。这一关键步骤不仅影响提取核酸的产量和纯度，还对核酸片段大小、NGS 应用和测序文库的质量产生重大影响。这些样本的纯度对测序结果的可靠性至关重要，这也体现了采用合适实验室设备和方法的重要性。
核酸提取的得率决定了从生物样本中提取 DNA 或 RNA 的产量。高产量可确保为下游应用提供充足的核酸物质，而纯度则反映了是否存在可能影响测序结果的杂质。严格的提取方案可最大限度地提高产量和纯度，确保核酸物质的完整性，从而实现准确测序。此外，在短读长测序和长读长测序方法之间进行选择，表明了针对特定应用定制文库制备方案的重要性。在核酸提取过程中，DNA 或 RNA 可能会发生意外断裂，从而影响测序文库中片段大小的分布。
核酸提取方案选择
核酸的溶解度会影响其提取效率，尤其是在水相和有机相的分离过程中。此外，核酸还能在提取过程中与各种材料结合，如固相基质或磁珠。基于磁珠的提取方法因其自动化拓展性和与高通量工作流程的兼容性而广受欢迎。这些方法具有可靠性、可重复性和可扩展性，是现代 NGS 文库制备不可或缺的工具。
通过使用 CyBio FeliX 等自动化移液系统，各种方案（包括基于磁珠的提取和移液枪头提取技术）都能无缝集成到 NGS 文库制备工作流程中。CyBio FeliX 可将重复性的移液工作自动化，最大限度地减少人为参与和操作错误，最大限度地提高样品通量，确保所有样本的提取结果一致，加快 NGS 文库制备的速度和质量。
测序方法对文库制备的影响
所选的测序技术决定了文库制备过程，既可以进行通常为 50bp 至 300 bp 片段的短读长测序，也可以对整个 DNA 分子直至 Mbp 片段的核酸进行长读长测序。 片段大小在 NGS文库制备中起着至关重要的作用，因为它决定了核酸样品是否适合测序。通过控制片段化方法和孵育时间等因素，可以调整核酸提取方案以获得所需的片段大小，从而优化测序结果。
此外，文库制备工作流程和必要步骤取决于应用领域和核酸类型（DNA 或 RNA）。靶向测序侧重于基因组的特定区域，从而限制了数据分析的范围，同时减少了测序时间和成本。由于重点是基因组中较小的特定区域，因此测序的覆盖度要高得多。因此，靶向测序需要扩增基因组中的特定基因片段或基因组。相比之下，全基因组测序（WGS）能全面了解整个基因组序列，不会出现 PCR 扩增子的潜在偏差，适用于更广泛的应用。
用于文库制备的基因扩增仪重要指标的优化
测序结果的质量直接取决于文库制备的质量。文库制备的所有步骤都需要精确的温度控制，而 PCR基因扩增仪正是实现这一点的最佳平台。合适的基因扩增仪必须满足几个关键指标：
- 精确温度控制系统：精确的温度控制对减少 PCR 偏差和非特异性扩增风险至关重要。
- 反应条件可调：应避免出现温度过冲或过低的情况，因为这会因温度不确定而产生不理想的扩增产物。可以通过保持高效酶活力来确保获得最佳产量。
- 高性能热盖压力：无论使用哪种高度的耗材，耶拿基因扩增仪都能施加稳定的热盖压力，最大限度地降低样品蒸发的风险，确保反应条件的一致性，并防止交叉污染。
- 温度均一性：整个样品模块的温度均一性至关重要，温度均一性好，才能在所有样品孔位置提供相同的反应条件，从而生成可靠的测序文库。
- 兼容性：基因扩增仪应能与所有常见的PCR耗材兼容，包括用于单细胞测序的特殊适配器。
- 灵活性：样品模块可更换这点非常重要，当样品数量和反应体积发生变化时，能方便地更换成不同的样品模块。
Biometra基因扩增仪完全符合 NGS文库制备的要求。它具有多种产品型号和样品模块类型，灵活性高，适用于不同的样品处理量和工作流程需求。它们与市面上所有常用的 PCR耗材兼容。值得注意的是，Biometra TAdvanced基因扩增仪是经 10x Genomics验证和推荐的 PCR仪，可兼容其所有单细胞水平和空间样本分析技术的创新方法，这使得 Biometra TAdvanced成为一项面向未来应用的绝佳工具。通过解决这些关键问题，Biometra基因扩增仪确保了扩增的稳定性和高得率，从而提高 NGS文库制备的效率和可靠性。
“对我们的 HLA 诊断至关重要”
"Biometra TAdvanced基因扩增仪与 GenDx试剂盒相结合，对我们的 HLA诊断至关重要。TAdvanced的超高温控精度非常适合我们在干细胞和器官捐献方面的应用。该解决方案为我们提供了所需的稳定性、可重复性和耐用性"。
德国耶拿大学医院移植免疫学 EFI 主任 Volker Oberle 博士
片段大小选择和清理
核酸片段大小选择和清理是消除次优核酸片段的关键步骤。用于测序和精确生物信息分析的最佳片段大小因所选测序仪器不同而不同。例如，Illumina™ 系统通常使用 200 - 500 碱基对 (bp) 的片段效果最佳。测序效率会受到片段大小的影响。与较大的片段相比，低于 150 bp 的片段会导致接头和引物二聚体更倾向于聚集在流动池上，从而导致短片段数据的偏差。从成本角度看，片段大小选择和清理也很重要，高效的流程有助于降低测序的总体成本。
样本归一化和文库合并
归一化是 NGS 文库制备的关键步骤，可确保每个文库的代表性均匀，测序深度足够。它可以均衡多重测序的浓度，避免样本代表性过高或过低。代表性过高会浪费容量，而代表性不足则会导致读取深度差和数据丢失，从而可能浪费宝贵的样本。因此，对文库浓度进行归一化处理有助于以经济高效的方式生成一致可靠的 NGS 数据。
为节省资源，可将多个文库集中起来，在同一次运行中进行测序。将多个样本的测序文库合并到一次运行中，可确保流动池得到最佳利用，从而实现更经济的流程。
提供优化的可重复的移液操作
保持 NGS 文库制备的一致性对于获得可靠的测序结果至关重要。 从劳动密集型的手动移液到确保一致性和可扩展性，文库制备面临着巨大的挑战。手动移液不仅会消耗宝贵的时间，还会带来出错的风险。
CyBio FeliX移液工作站通过自动化工作流程消除了操作变化性，确保了结果的可重复性，提高了可靠性和效率。CyBio FeliX在片段大小选择和文库规范化等任务中具有无与伦比的优势。在人工加样处理过程中，要在许多样本中实现参数的一致性可能具有挑战，从而导致片段大小选择的偏差和结果偏差。 有了 CyBio FeliX，您就不再需要重复性的人工移液操作，从而有了 “走开的时间”——可以专注于高价值分析和需要您专业知识的任务。
使用灵活的 CyBio FeliX实现工作流程自动化，可减少手动移液的工作量，而且仪器体积小巧。从核酸提取到文库汇集，可满足多种应用，且占地面积小。由于每天的样本数量不同，有些时候样本量大，可能无法进行人工处理。而有些时候可能只有少量样本。CyBio FeliX具有很大的样品通量灵活性——可处理 1至 96个样本，最多可达 384 个样本。
随着样本量的增加，可扩展性变得至关重要。FeliX 的模块化设计可实现无缝扩展，在不牺牲效率或质量的情况下满足不断增长的需求，为未来的 NGS 工作流程做好准备。
"CyBio FeliX为优化我们的工作流程做出了巨大贡献
"FeliX实现了DNA片段大小选择的自动化。这种自动化不仅提高了处理不断增加的样本数量的效率，还提高了大小选择的质量。我们对这种性能感到非常兴奋"。
Eugen Bauer，科隆大学输血医学系
"CyBio FeliX提高了结果的一致性，节省了时间"
“CyBio FeliX对我们来说是一个很好的工具，可以让我们用标准化的程序来进行磁珠纯化和多个测序文库的合并。它帮助我们提高了测序结果的一致性，并通过实现即用即走来节省我们的实验时间"。
Julie Bitz-Thorsen，哥本哈根大学灵北基金会地理遗传学中心
重要的质量控制评估
在 NGS 文库制备过程中，质量控制对确保下游测序过程的成功起着至关重要的作用。利用 qPCR 进行精确定量，利用凝胶电泳进行片段大小验证，您就可以放心地验证 DNA 片段的质量和数量，优化 NGS 工作流程，获得可靠、可重复的结果。
qPCR被公认为NGS文库制备中量化DNA片段的金标准
qPCR 被公认为 NGS 文库制备中量化 DNA 片段的黄金标准。它不仅得到了 NGS 试剂盒供应商的认可，也被全球研究人员公认为首选方法。通过 qPCR 确定文库浓度可精确量化多个样本之间的最佳归一化因子，从而通过优化流动池负载获得最佳结果。此外，qPCR 是一种具有成本效益的技术，可最大限度地减少对多余样品材料的需求，避免不必要的重复实验，从而降低成本，优化资源利用。
凝胶电泳验证片段大小
凝胶电泳是检测 DNA 片段大小的有效方法。耶拿分析公司可提供适合各种产量的解决方案：您可以根据自己的需要选择紧凑型凝胶电泳系统（Compact Line）中的S、M、Multi-Wide和L型凝胶电泳系统。凝胶电泳是一种经济高效的方法，能让您经济地利用资源。
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Br NGS Library Preparation (EN)
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Infografik_NGS_001_2024_en
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Ancient Genomics: Semi-Automated High-Throughput Workflow for the Preparation of NGS Libraries (Poster)
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HLA Typing Using Long-Range PCR and Next-Generation Sequencing (EN)
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DNA Amplicon Library Preparation for Illumina® Sequencing (EN)
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Workflow for Preparation of NGS Libraries in Ancient Genomics (EN)
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Automated Purification of Plasmid DNA using Promega Wizard MagneSil Tfx™ System on the Analytik Jena CyBio FeliX Liquid Handler (EN)
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